您的位置 > cd3单克隆抗体活化的杀伤细胞对人胃癌
细胞株mnk45体外杀伤及裸鼠体内
抑制作用的实验研究
白云飞 张学庸 牟震先 吴觉平
摘要 用人的外周血单个核细胞（pbmc）与抗cd3单克隆抗体和基因重组的人il-2共同培养制备cd3ak细胞（cd3mcab activated killer cells），pbmc与ril-2共同培养制备lak细胞，用单纯pbmc作为对照细胞，对这三种细胞的增殖及在体外和裸鼠体内的抗人胃癌细胞株mnk45作用进行了实验研究。体外试验结果表明，cd3ak对mnk45有明显杀伤作用，而lak细胞杀伤率较低，二者差异有非常显著性意义（p＜0.01）；用mtt法和台盼蓝活细胞计数法测定这三种细胞的增殖能力和细胞数量的增加，表明cd3ak的增殖能力和扩增数量均明显高于la细胞（p＜0.01）。裸鼠体内试验结果显示，对照组及lak组全部长出瘤结节
cd3ak组无一例长出皮下结果，且生存明显长于前者。
被动输入淋巴因子激活的杀伤细胞（lak）在某些肿瘤的生物疗法（biotherapy）中取得了良好效果。但是，lak疗法由于其显著的缺点，即治疗所需相当量的效应细胞难以满足和辅以大量il-2，产生一系列副作用，使其进一步推广应用受到限制。近年来，cd3单克隆抗体激活的杀伤细胞（cd3ak），由于其扩增速度、细胞毒活性及体内抗肿瘤活性显著优于lak细胞而日益受到重视。本实验研究观察了cd3ak的增殖效应，对胃瘤细胞株mnk45的体外杀伤及裸鼠体内移植性胃癌的抑制作用。
材料与方法
1.靶细胞来源：肿瘤细胞mnk45系人胃低分化腺癌，由西京医院消化内科实验室提供，在含10 ％小牛血清的rpmi-1640完全培养基中37℃、5％co2条件下培养，活细胞率＞95％。
2.抗体及il-2的来源：cd3单克隆抗体由第四军医大学免疫教研室提供；基因重组人il-2由第四军医大学药物研究所提供；3g1/3f8抗体系抗流行性出血热单克隆抗体，第四军医大学流行病学教研室提供，为无关抗体。
3.实验动物：为balb/c裸鼠，6周龄，由第四军医大学动物实验中心提供并在无菌条件下代养。
4.效应细胞及对照细胞的制备：取健康献血者外周血并抗凝，经比重为1.077的淋巴细胞分离液（ficoll）分离得到单个核细胞（pbmc）；用完全培养液（含有10％灭活小牛血清、0.01％丙酮酸钠、0.24％ hepes、0.2％ nahco3、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml）制成1×106/ml细胞悬液，分为四个组培养：第一组加300u/ml的ril-2制备lak细胞；第二组加cd3单抗（为1/500稀释度，即cd3抗体腹水原液/效应细胞悬液）。ril-2 30u/ml以制备cd3ak；第三组只加1/500稀释度的cd3单抗制备atc anti-cd3 activated t cells）；第四组为不加试剂或只加无关抗体3g1/3f8的pbmc。
5.细胞毒作用的检测：我们用51cr标记mnk45，采用传统的51cr4小时释放法检测杀伤作用，设最大释放组（加2v triton x-100）及自然释放组，设不同效/靶比，在96孔v型塑料板中进行。最后取上清在γ计数仪上测定min-1值（曾用cpm值），并算出特异性杀伤率。
6.细胞扩增检测：
(1)我们采用mtt（四甲基偶氮唑盐）法测定细胞增殖能力：培养的淋巴细胞浓度为1×106/ml、200μl/孔加入平底96孔板，设三个复孔，再加浓度为5mg/ml的mtt，25μl/孔， ％co2下孵育4小时；1500r/min离心后轻轻吸出150μl/孔上清，再加入150μl/孔的二甲基亚砜，静置10分钟后在酶联检测仪上（570nm）测定吸光度（a，曾称光密度od）；用每组三个复孔a值的平均值来比较，a值高，则增殖快。
(2)以0.2％台盼蓝活细胞计数法估计细胞数量的增加。
7.cd3ak细胞在裸鼠体内对mnk45的抑制作用的检测：本实验采用winn氏中和法，将裸鼠随机分为三组，每组4只：第一组为肿瘤细胞对照组；第二组为lak细胞对照组，lak：mnk45(106)为20:1，皮下注射；第三组为cd3ak组，方法同lak组。观察皮下瘤结节生长情况及裸鼠的生存期。
结 果
一、效应细胞的扩增
1.计数法估计效应细胞的数量：结果见表1。cd3ak至第2周增加100倍，而lak细胞只增加20倍。cd3ak至第3周增加近1000倍，而lak细胞则无明显增加。经配对t检验，差异有非常显著性意义（p＜0.01）。
表1 效应细胞经培养后的扩增情况
培 养 天 数
组别
4
8
12
16
20
cd3ak
3±0.25
40±2.03
102±3.57
425±5.28
987±7.25
lak
1±0.24
10±1.93
20±4.12
23±3.43
26±6.23
注：n＝10，p＜0.01。表内数据为开始培养时细胞数的倍数
2.mtt法估计效应细胞增殖能力：由表2可见，cd3ak在第一周增殖能力最强，第二、三周仍维持其高水平的增殖能力；而lak细胞在第一周时最高，第二周便降得很低，至第三周时几乎等于零。经配对t检验，二者差异有显著性意义（p＜0.01）。
表2 mtt法在各周测的a值
周次
组别
1
2
3
4
lak
0.56±0.25