您的位置 > 转染用lipofctamine法将pdtkz转染胃癌细胞，经g418筛选2周，将抗性细胞扩增。而未经转染的细胞在g418作用6d后全部死亡。
核酸杂交细胞总rna斑点杂交结果见图3。sgc 7901/tk细胞总rna出现阳性杂交信号，而亲代sgc 7901细胞则无杂交信号。
gcv对sgc 7901/tk的体外杀伤作用结果见图4.5。可见gcv对sgc 7901/tk细胞有明显的杀伤作用，其ic50值72h为2.1μg/ml。而gcv对亲代sgc 7901细胞则无明显毒性（p＜0.01）。
旁观者效应在混合细胞中sgc 7901/tk细胞比例（％）分别为0、10、20、40和80时，gcv对混合细胞的杀伤率（％）依次为：0、38.6、81.9、95.3和98.1。
gcv对sgc 7901/tk的体内抑瘤作用 结果见图6。图6所示gcv在体内对sgc 7901/tk细胞（①组）有明显的生长抑制作用，对亲代sgc 7901细胞（③组）则无明显毒性（p＜0.01）。
讨 论
将外源性目的基因转移到真核细胞内，使其在细胞内获得表达，是进行基因治疗的目的，此过程的关键是构建目的基因的重组真核表达载体。pdor-neo是一种逆转录病毒载体，它可以整合进入宿主细胞基因组中，表达外源性基因。我们将hsv-tk cdna从pic19r/mci-tk中切下，并定向克隆入pdor-neo中，成功地构建了hsv-tk基因的重组逆转录病录真核表达载体pdtkz。经酶切鉴定在pdtkz转入人胃癌细胞中，经g418筛选3周，其抗性细胞即认为是hsv-tk表达阳性细胞（sgc 7901/tk）。rna斑点杂交结果也表明，其阳性转染细胞总rna中，有能与hsv-tk基因双链探针杂交的序列，提示细胞内有hsv-tk的mrna转录，而亲代sgc 7901细胞总rna则无阳性杂交信号。说明pdtkz已被转入胃癌细胞内，并且hsv-tk基因获得了表达。
目前在肿瘤药物敏感基因中，应用最多的是hsv-tk基因〔2〕。我们用自己构建的hsv-tk基因真核表达载体pdtkz，成功地将hsv-tk基因导入人胃癌细胞中，并获得了表达。当用其特异性底物gcv处理时，发现gcv在体外对sgc 7901细胞有明显的杀伤作用，其杀伤作用呈现剂量依赖性和时间依赖性特点。体内实验也表明，将sgc 7901/tk细胞接种裸鼠皮下，形成肿瘤后给于gcv治疗，可抑制肿瘤生长，使已形成的肿瘤逐渐缩小，最后完全消失。体内外实验结果显示gcv对hsv-tk阴性的亲代sgc 7901细胞无明显毒性，无任何杀伤或抑瘤作用。关于hsv-tk/gcv系统杀伤肿瘤细胞的机理。目前认为，tk是dna合成补救途径的一种酶，可催化脱氧胸苷（dthd）磷酸化，真核细胞中的细胞tk特异性很强，底物范围很窄，只能催化dthd磷化生成脱氧胸苷酸。而hsv-tk除此之外，还可以催化一些核苷类似物如gcv等磷酸化〔3〕。这些核苷类似物对真核细胞无毒性或无活性，且不能在细胞tk作用下磷酸化，因而对hsv-tk阴性细胞毒性很低或无毒性，但在hsv-tk阳性表达的细胞中，因其可被磷酸化生成对细胞有毒性的产物，因而抑制细胞dna的合成，使细胞死亡。目前用于hsv-tk基因转移治疗肿瘤的特异性底物有两类，一类是嘌呤核苷类似物（如acv、gcv等）〔4〕，另一类是嘧啶核苷类似物（如bvdu）〔5〕。这两种核苷类似物被hsv-tk磷酸化后，抑制肿瘤细胞生长的机制不同〔6〕。gcv的磷酸化产物主要是抑制细胞dna聚合酶的活性，或作为dgtp的竞争性抑制物，掺入到合成的dna中去，阻断dna链的延长。bvdu的磷酸化产物则主要是通过强烈地抑制细胞的胸苷酸合成酶，从而抑制dna的合成。
本实验结果还表明，将表达hsv-tk基因的胃癌细胞暴露于gcv之后，不仅hsv-tk阳性细胞被杀死，而且与其共同培养的hsv-tk阴性细胞也可被杀死。当hsv-tk阳性细胞与阴性细胞比例为1:5时，gcv就可将大部分（81.9％）的混合培养细胞杀死。此现象称之为“旁观者效应”（bystander effect）〔7〕。关于旁观者效应的机制， 一般认为是gcv的磷酸化产物扩散至周围的肿瘤细胞而产生。但freeman等〔8〕提出，此现象可能与细胞凋亡有关。他们发现hsv-tk阳性细胞在gcv的作用下，出现细胞固缩，核染色质致密，形成“凋亡小体”等细胞凋亡的表型特征，而凋亡小体又可被周围的hsv-tk阴性细胞摄取或细胞间通过缝隙连接进行胞质交换，使hsv-tk阴性细胞死亡。阻断凋亡小体的转移可阻止这种旁观者效应。显然，旁观者效应大大加强了hsv-tk/gcv系统杀伤肿瘤的效果。
总之，hsv-tk/gcv基因治疗系统有其许多特有的优点：如选择性地杀伤基因转染细胞，旁观者效应，低剂量的gcv即可杀伤快速增殖的肿瘤细胞，对相对静止的正常细胞产生毒副作用小等。但也有许多不足：首先，hsv-tk基因不可能100％地转移入所有肿瘤细胞，虽有旁观者效应存在，也不能将所有肿瘤细胞杀死〔9〕。其次，旁观者效应虽加强了gcv杀伤作用，但在体内同时也可杀伤肿瘤周围的正常组织细胞，尤其对增殖分裂相对活跃的胃肠道上皮细胞。故hsv-tk/gcv系统在治疗胃肠道肿瘤中的作用会受到一定的限制，不象在治疗脑肿瘤时有更多的优越性。最后，在体内基因转移方法的选择，转染率的高低、体内各种因素（如免疫因素）的影响等，均可影响hsv-tk/gcv肿瘤基因治疗系统的临床使用。相信随着基因转移方法的不断改进，基因表达与调控基础研究的不断深入，以及基因治疗体内机制的不断澄清，这种方式将可能成为肿瘤基因治疗的有效策略之一。