您的位置 > 从免疫组化结果来看，转染细胞topoii表达改变不明显。对转染细胞topoii活性的测定也未发现其活性有明显改变。看来hsp90β的低调对topoii影响不大。
hsp90β低调使药物敏感性的增高可能机制：（1）pgp表达减低；（2）gst活性减低；（3）促凋亡。
结论：
1．在人胃粘膜正常组织，胃炎及癌旁组织中有少量的hsp90β表达，阳性表达率为11%-13%；在胃癌组织中hsp90β的表达增高增强，阳性表达率为30%。
2．在胃癌多药耐药细胞系sgc7901/vcr中，hsp90β的表达明显高于其亲本细胞。
3．反义hsp90mrna抑制了hsp90β蛋白的翻译。
4．hsp90β低表达可使细胞生长受到不同程度的抑制。
5．肿瘤hsp90β蛋白低表达后对化疗药物的敏感性增高，但对不同细胞系、不同化疗药物，敏感性增高程度不同。
6．转染反义hsp90mrna后，各细胞系pgp表达均降低，gst活性降低，topoii的活性及表达无明显改变。
关键词 胃癌 hsp90β 多药耐药 反义核酸 药物敏感性 pgp gst topoii
hsv-tk基因治疗系统对人胃癌细胞的杀伤作用
摘 要 目的：构建单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶（hsv-tk）基因的重组逆转录病毒真核表达载体，并将其转染胃癌细胞，观察hsv-tk/gcv（丙氧鸟苷）基因治疗系统对胃癌细胞的杀伤作用。方法：用ecori和sall酶切质粒pic19r/mci-tk，回收1.7kb的hsv-tk基因片段，将其定向克隆入逆转录病毒载体pdor-neo的多克隆位点。用l ipofectamine法将hsv-tk基因转染胃癌细胞系sgc 7901。测定阳性转染细胞（sgc 7901/tk细胞）在体外对gcv的敏感性，并将其接种于裸鼠皮下，观察gcv在体内对胃癌细胞的抑制作用。结果：经酶切鉴定，成功地构建了hsv-tk基因的真核表达载体pdtkz，并将其转入胃癌细胞。体外实验表明，gcv对sgc 7901/tk细胞有明显的杀伤作用，其作用呈现剂量和时间依赖性特点，且同时表现出对其周期亲代sgc 7901细胞的杀伤效应（旁观者效应）。体内实验表明，gcv可抑制hsv-tk阳性胃癌细胞的生长，使已形成的肿瘤逐渐消失。而gcv对hsv-tk阴性的亲代sgc 7901细胞在体内外均无明显的杀伤和抑瘤作用。结论：结果表明，逆转录病毒载体介导的hsv-tk基因转移胃癌细胞，配合以gcv治疗，是胃癌基因治疗的又一理想途径。
将药物敏感基因（drug sensitivity gene）或者称“自杀”基因（suicide gene）转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞内特异地表达。当应用相应药物治疗时，其基因产物可将无毒性或无活性的前体药物转变成细胞毒性药物，从而杀伤局部肿瘤细胞，此为肿瘤基因治疗的有效方法之一。为此，我们构建了单纯疱疹病毒的脱氧胸苷激酶（hsv-tk）基因的重组逆录病毒真核表达载体，并转染胃癌细胞，观察hsv-tk/丙氧鸟苷（gcv）基因治疗系统对胃癌细胞的杀伤作用。
材料和方法
材料质粒pic19r/mci-tk由美国匹兹堡大学药理教研室huang l.教授惠赠，内含1.7kb的hsv-tk cdna；逆转录病毒载体pdor-neo由生化教研室惠宏襄博士惠赠；lipofectaminetm kit购自美国gibco-brl公司；g418、mtt均为sigma产品；胃癌细胞系sgc 7901由本实验室提供。
质粒重组用限制性内切酶ecor ⅰ加sal ⅰ消化pic19r/mci-tk，经凝胶电泳证实有所需1.7kb的hsv-tk cdna片段，回收。pdor-neo分别用bamh ⅰ、ecor ⅰ和salt ⅰ酶切鉴定后，用ecor ⅰ加sal ⅰ酶切，电泳、回收、取回收的hsv-tk cdna片段及pdor-neo，经t4 dna连接酶连接，转化大肠杆菌hb101，铺板培养，挑选克隆，小量碱裂解法提取重组质粒，酶切鉴定，并命名为pdtkz。
转染采用lipofctamine将pdtkz转染胃癌细胞系sgc 7901，转染后用g418(800μg/ml)筛选3周，将抗性细胞（即为阳性转染细胞，命名为sgc 7901/tk）在g418（200μg/ml）下常规培养扩增。
细胞总rna斑点杂交（dot blot）分别提取sgc 7901/tk和sgc 7901细胞总rna，将两组rcn分别点样至硝酸纤维素膜上，用[α-32p]datp缺口平移法标记hsv-tk基因双链探针，行细胞总rna斑点杂交。
sgc 7901/tk细胞对gcv的体外敏感性测定 分别将sgc 7901/tk和sgc 7901细胞接种96孔细胞培养板，并加入gcv使终浓度分别为：100、10、1.0、0.1、0.01μg/ml，每一浓度每种细胞做5个复孔，常规培养72h，mtt法测定杀伤率〔1〕。同法分别接种两种细胞，加入gcv(1.0、0.1μg/ml)，分别于24、48、72、96、120h用mtt法测定杀伤率。
旁观者效应（bystander effect）测定
将sgc 7901/tk和sgc 7901细胞按不同比例混合接种，加入gcv使终浓度为10μg/ml，常规培养6d，胎盼兰染色法计数活细胞，并计算杀伤率。
sgc 7901/tk细胞对gcv的体内敏感性测定 分别将sgc 7901/tk和sgc 7901细胞接种于balb/c裸鼠皮下，一周后测量肿瘤大小，同时腹腔内注射gcv(50mg/kg，每天1次，共14d)，对照组注射生理盐水，定时测量肿瘤大小，记录死亡时间。
结果
质粒鉴定pic19r/mci-tk酶切鉴定的结果见图1。图1所示hsv-tk cdna为1.7kb的片段；逆转录病毒载体pdor-neo为6.5kb，符合其物理图谱。pdtkz酶切后，电泳呈两条dna带，分别为1.7kb与6.5kb左右（图2），表明hsv-tk基因已插入到pdor-neo载体中。