您的位置 > ②利用lipofectamine将重组质粒pcdna—amrp转入sgc7901细胞，经g418抗性筛选后有g418抗性的细胞克隆形成，命名为m-sgc7901。
③打点杂交显示m-sgc7901中有mrp mrna表达的减少，提示有mrp反义rna的表达。
④m-sgc7901细胞生长曲线表示mrp反义rna对m-sgc7901细胞的生长无明显影响。
⑤mtt显示m-sgc7901与其亲本细胞相比对vcr敏感明显增加，其ic50降低64倍（p%26lt;0.05）。
⑥流式细胞仪显示经vcr处理后m-sgc7901细胞的生长停滞于g1期，表现为g1期细胞明显增多，s期细胞明显减少（p%26lt;0.05）。
⑦m-sgc7901细胞内gst活性变化不明显（p%26lt;0.05）。
上述结果提示：
1．在m-sgc7901细胞中mrp反义dna能有效抑制 mrp mrna的表达。
2．mrp mrna表达的下降并不影响m-sgc7901细胞的生长速度，但显著增加了该细胞系对化疗药物vcr敏感性。
3．mrp mrna表达的变化对gst活性无明显影响。
关键词：胃癌 多药耐药 多药耐药相关蛋白 反义核酸 基因治疗
四、反义hsp90 mrna对消化系肿瘤细胞药物敏感性的影响
1．了解hsp90β在人胃癌细胞中的表达及在人胃癌耐药细胞系中的表达。
2．构建反义hsp90 βmrna真核表达载体，转染人消化系肿瘤细胞系，以了解反义hsp90βmrna对肿瘤细胞药物敏感性的影响。
方法：
sabc免疫组化法了解hsp90β在人胃癌细胞中的表达及在人胃癌耐药细胞系中的表达。从原始质粒phhsp90中用ecori及bamhi消化下一长约1.0kb，3’端为bamhi,5’端为ecori的片段，将此片段反向克隆入pcdna的bamhi、ecori位点，构建反义hsp90βmrna真核表达载体。lipofectamine介导基因转染入胃癌细胞系sgc7901，胃癌多药耐药细胞系sgc7901/vcr，人肝癌细胞系hcc7402及食道癌细胞系ec109，用g418筛选出h-sgc7901，h-sgc7901/vcr，h-hcc7402及h-ec109抗性克隆。用打点杂交及rna保护分析法证明基因转染细胞有反义hsp90mrna表达。westem blot及/或sabc免疫组化法检验hsp90β、pgp及topoⅱ的表达。mtt法测定转染细胞对化疗药物的敏感性，pcm测定转染细胞内adr的聚集。
结果：
在胃粘膜正常组织，胃炎及癌旁细胞中有少量的hsp90β表达。阳性表达率分别为11.76%、13.04%及11.42%，各组之间无显著差异(p%26lt;0.05)。在胃癌组织中hsp90β的阳性信号增强，阳性表达率增高，阳性率为30.00%，显著高于前三组(p%26lt;0.05)。其中在高分化胃腺癌中hsp90β的阳性率为15.38%，中分化腺癌中的阳性率为31.25%，低分化腺癌中的阳性率为33.33%，粘液腺癌中的表达率为42.85%。各组hsp90β的阳性表达率有显著差异。(p%26lt;0.05)。hsp90β主要分布于胃癌细胞的胞浆中。此外，在胃癌多药耐药细胞系sgc7901/vcr中，hsp90β的表达明显高于其亲本细胞。
从原始质粒phhsp90中消化下一长约1.0kb 3’端为bamhi,5’端为ecori的片段，将此片段反向克隆入pcdna的bamhi、ecori位点，构建反义hsp90 mrna真核表达载体pcdna-hsp90，经bamhi、ecori酶切鉴定证明构建成功。
用lipofectamine 将重组质粒pcdna-hsp90转染sgc7901，sgc7901/vcr，hcc7402及ec109细胞。利用真核表达载体pcdna中含有的新霉素抗性基因neo用g418进行抗性筛选。筛选出sgc7901，h-sgc7901/vcr，h-hcc7402及h-ec109抗性克隆。
打点杂交及rna保护分析证明pcdna-hsp90转染细胞后筛选的克隆有反义hsp90 mrna表达。westem blot及免疫组化结果证明h-sgc7901，h-sgc7901/vcr，h-hcc7402及h-ec109的hsp90β蛋白表达降低。hsp90低表达可使细胞生长受到不同程度的抑制。使h-sgc7901/vcr及h-ec109的s期明显减少。不同细胞系对不同药物的敏感性不同，总体来讲，对各种化疗药物的敏感性依次为sgc7901，hgc7901/vcr，hcc7402及h-ec109，其中sgc7901，h-sgc7901及hcc7402对各种化疗药物较敏感，sgc7901/vcr，ec109对各种化疗药物不敏感。耐药细胞sgc7901/vcr与其亲本细胞sgc7901相比，对adr、vcr、mmc及ctx的耐药指数分别为251898.7,628.14及6.32倍。hsp90β蛋白低表达后对化疗药物的敏感性增高，但对不同细胞系、不同化疗药物，敏感性增高程度不同。h-sgc7901对adr、vcr、mmc的敏感性较亲本细胞分别增加了10倍；10000倍及24.8倍，对ctx的敏感性无明显改变。sgc7901/vcr对adr、vcr、mmc及ctx的敏感性较亲本细胞分别增加了3.98倍，6.28 倍及3.15倍及5.01倍。h-hcc7401对adr及vcr的敏感性较亲本细胞分别增加了47.77倍及10倍。对mmc及ctxa的敏感性无明显改变。h-ec109对adr、vcr、ctx的敏感性较亲本细胞分别增加了31622.77,22.44倍及 3.16倍，对mmc的敏感性 无明显改变。转染细胞与adr作用后的荧光强度较亲本细胞增强，说明细胞内adr聚集增多。其中h-hcc7402及h-ec109细胞中adr聚集更为明显。与mtt法测得h-ec109及h-hcc7402细胞分别较其亲本细胞对adr的敏感性明显增高相一致。
免疫组化结果表明，转染反义hsp90 m rna后，各细胞系pgp表达均降低。说明pgp的表达与hsp90β低调可以使pgp的表达降低。pcdna-hsp90转染细胞gst活性较其亲本细胞显著降低。h-sge7901，h-sgc7901/vcr、h-hcc7402及h-ec109细胞较其亲本细胞的gst活性分别降低了2.241倍，8.942倍，17.951倍及3.801倍(p%26lt;0.05)。其中h-hcc7402细胞 gst活性降低最为明显。