您的位置 > ⒌转染细胞的周期分布：fcm分析显示，sgc/pcna细胞与sgc-7901相比，g1期细胞增加20.5％，s期和g2/m期细胞分别减少29.8％和21.2％。sgc/neo与sgc-7901细胞相比无明显变化（附表）。
附表 fcm测定细胞周期分布
dna含量（％）
组别
g0/g1
s
g2＋m
sgc-7901
57.1
32.6
10.4
sgc/neo
48.1
30.8
21.1
sgc/pcna
68.8
23.0
8.2
⒍转染细胞超微结构变化：透射电镜观察sgc-7901和sgc/neo细胞形态正常，核仁、染色体及细胞器清晰可见，核膜包膜完整。而sgc/pcna细胞形态出现多种改变，不仅有空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀，而且部分细胞出现核染色质浓集成块，在核膜下边集，呈月牙状。
讨论
胃癌的发生机制十分复杂，不仅涉及多种癌基因、抑癌基因的变化，而且一些细胞因子在胃癌的发生发展中也起到一定的作用。尽管这些基因、细胞因子对细胞的作用方式不同，作用途径和作用部位有别，但最终结果都将导致细胞的恶性增殖。因此，遏制细胞的恶性增殖是肿瘤治疗的基础。
pcna作为dna聚合酶δ的辅助因子，不仅在dna复制中起到关键作用，而且来自细胞内外的增殖信号都须经过pcna的参与，才能引发dna的合成。众多研究表明，pcna在几乎所有肿瘤组织中都有高度表达， 我们免疫组化研究也表明，pcna在胃癌的阳性表达率为100％，并与胃癌淋巴结转移密切相关。为此，我们选择pcna作为胃癌基因治疗的靶位，用真核细胞质粒载体表达pcna反义rna特异性封闭肿瘤细胞的mrna，以期控制癌细胞的增殖，达到治疗肿瘤的目的。实验结果表明，当pdr-pcna转染胃癌细胞后，反义rna单链探针检测到sgc/pcna细胞内pcna正义rna水平水平降低47.5％；转染细胞的免疫组化染色强度明显降低，阳性细胞所占比例下降；sgc/pcna生物速度明显减慢，g1期dna含量增多，而s期、g2/m期含量降低。这些变化主要是由于pcna被抑制后，细胞内dna合成减少，致使癌细胞增殖受阻。此外，sgc/pcna细胞超微结构发生了变化，如空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀等，部分细胞出现胞浆固缩和染色质浓缩边集等改变。这种变化是否与细胞凋亡有关，还有待进一步证实。有关pcna与凋亡的关系尚未见报道，但这一现象的出现，为我们更深入了解pcna的作用及细胞调控机制提供了一种参考数据。
上述结果提示，用pcna基因反义rna阻断某特定的基因表达，可以抑制sgc/7901胃癌细胞的增殖，改变肿瘤细胞的生物学行为。合理地利用反义技术以改变和逆转肿瘤细胞的恶性表型，是肿瘤基因治疗的一个方向。
二、癌特异性阿霉素免疫脂质体的制备及其特性的研究
摘 要
应用抗人胃癌单克隆抗体mgb2制备阿霉素免疫脂质体，并对其理化及免疫学特性进行观察。采用逆相蒸发法和修饰抗体插入法并加以改良。125i-mgb2 测得抗体插入率878±58%，抗体修饰度15.1% ，药物包裹率47.6%±8.1%。免疫脂质体经电镜负染观察为大单层脂质体，直径105.6±21.1nm。每个免疫脂质体平均包入5600分子阿霉素，插入48分子mgb2 。间接免疫荧光和elisa证实抗体活性保持良好。结合实验证明免疫脂质体可特异地结合并将其内容特携带至人胃癌靶细胞。免疫脂质体对人胃癌靶sgc-7901显示选择性杀伤作用，其杀伤力是游离阿霉素的2.2倍，是非特异脂质体的23.1倍，但对正常人胚肺细胞sl7毒性小，结果表明，制备的胃癌特异性免疫脂质体对阿霉素具有较好的导向作用。经过动物实验，该免疫脂质体将可能用于胃癌的导向治疗。
三、mrp反义rna对胃癌细胞系sgca7901化疗药物敏感性的影响
摘 要 目的：本研究应用分子生物学技术，构建mrp反义rna真核表达载体，转染胃癌细胞系sgc7901，观察mrp反义rna对化疗药物vcr敏感性的影响以及mrp mrna表达的变化对gst活性的影响，以进一步明确gst与mrp介导的耐药之间的关系，同时为mrp作为目的基因进行临床肿瘤多药耐药的基因治疗奠定一定的实验基础。
方法：
1．1用bamhi和 xhol双酶切原始质粒pbmrp释放出—1kb的mrp cdna片段，通过基因重组技术将该基因片段插入真核表达载体pcdna3.1(-)的bamhi和 xhol酶切位点之间。将重组质粒命名为pcdna3—amrp。
2．通过脂质体介导将重组的真核表达载体转染到胃癌细胞系sgc7901细胞中，经g418抗性筛选，获得稳定转染的细胞克隆，并命名为m-sgc7901。
3．应用32p标记mrp单链寡核苷酸探针和核酸打点杂交技术检测m-sgc7901细胞中mrp mrna表达的变化。
4．通过描绘细胞生长曲线，观察mrp反义rna对m-sgc7901细胞生长速度的影响。
5．应用mtt检测m-sgc7901细胞对vcr敏感性的变化。
6．应用流式细胞仪观察经vcr处理后m-sgc7901细胞周期的变化。
7．检测m-sgc7901细胞内gst活性的变化。
结果：
①原始质粒pbmrp经bamhi和xhoi双酸切消化释放出一长约1kb的mrp cdna片段，5’端为bamhi位点，3’端为xhoi位点，将此片段反向克隆到pcnda的bamhi和xhoi位点，建成mrp反义rna真核表达载体pcdna—amrp，经bamhi和xhoi酶切鉴定证明构建成功。