您的位置 > 一、增殖细胞核抗原基因反义rna表达质粒的
构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应
戴林 张学庸 惠宏襄 王成济 樊代明
【摘要】 目的 观察增殖细胞核抗原（pcna）基因反义rna表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法 用dna重组方法将人pcna基因反向克隆到真核表达质粒pdor-neo中，构建成人pcna基因真核表达质粒pdr-pcna，用脂质体介导转染人胃癌细胞系sgc-7901。结果 经g418筛选获得转染细胞sgc/pcna，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，rna、蛋白质的生物合成受到抑制，s期、g2/m期dna含量降低。结论 pcna基因反义rna对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。
【主题词】 胃肿瘤 细胞株 增殖细胞核抗原 rna，反义 基因治疗
增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，pcna）是dna聚合酶δ的辅助因子，在dna复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。pcna在许多肿瘤组织中都有高表达，并随肿瘤浸润深度增加及转移，其表达呈明显上升趋势。sakakura等用18-mer pcna反义odn抑制了多种胃癌细胞系的生长。提示pcna与肿瘤发生、发展关系密切，有可能成为肿瘤基因治疗的靶点。为研究pcna基因与胃癌的关系，探索胃癌基因治疗的靶基因，我们构建了人pcna基因反义rna真核表达质粒，并观察其对人胃癌细胞的抑瘤效应。
材料与方法
⒈基因与载体：pt7hpcna质粒由美国冷泉港分子生物学实验室waga博士惠赠，在其表达载体p30382xt的xbal、bamhi位点间插有人pcna基因。真核细胞表达质粒pdor-neo由英国皇家癌症研究会morgenstem博士惠赠。
⒉主要试剂：lipofect aminetm脂质体药盒购自gibco公司，g418购自sigma公司，[α-32p]utp购自北京福瑞公司，限制性内切酶、连接酶购自华美生物技术有限公司。
⒊质粒制备：dna片段回收、dna连接、细菌转化及基因鉴定参照《分子克隆实验指南》进行。
⒋dna转染：用lipofect aminetm介导将空载质粒pdor-neo及重组质粒pdr-pcna转染至人胃癌细胞sgc-7901（由军事医学科学院毒物药物研究所引入），分别命名为sgc/neo和sgc/pcna，并以sgc-7901作为阴性对照。转染72小时后，用g418（400μg/ml）筛选3周，挑取单个抗性细胞在g418（100μg/ml）下常规培养扩增。
⒌细胞生长曲线：在24孔培养板中，分别于每孔接种每亳升3×104个细胞，每日取各种克隆细胞株3孔，0.25％胰酶消化计数，连续5天，绘制出生长曲线。
⒍rna单链探针的制备及rna斑点杂交：将pcna基因头尾端克隆至peg3z质粒的hindⅲ和bamhi位点间，分别利用sp6、t7启动子体外转录盒（riboprobe kit，美国promega公司），及[α-32p]utp标记出正义和反义pcna rna单链探针。提取sgc-7901和经转染72小时后的sgc/pcna细胞rna，按常规方法进行rna斑点杂交。
⒎免疫组织化学染色及图像分析：取经转染72小时的3组细胞爬片，经冷丙酮固定后，进行abc免疫组化染色，观察pcna表达的变化，同时进行图像分析。
⒏细胞周期测定：取1×106对数生长期单细胞悬液，0.01 mol/l ph7.4pbs洗涤后，70％乙醇固定，pi（propidium iodide）染色，应用partec-caⅱ型流式细胞仪（fcm）检测细胞dna含量。
⒐透射电镜观察：sgc/pcna、sgc/neo和sgc-7901 3种细胞各取1×106，经0.01mol/l ph7.4pbs洗涤后，加入6％小牛血清白蛋白，粘合反应30分钟，离心弃上清，25％戊二醛4℃固定24小时，按常规电镜制作技术制备电镜标本，600-800nm的超薄切片收集于带膜的铜网上，经铀、铅电子染色后，行电镜（jem-2000ex）观察。
结果
⒈pcna反义rna表达质粒的构建及鉴定：用bamhi和xbal酶切质粒pt7hpcna，得到1.3kb人pcnacdna全长序列，将其插入到puc19质粒bamhi-xba ⅰ间，成为puc-pcna，再分别用pstl、ecori、kpn i和sal i-bamhi进行酶切分析，得到大小不同的片段。这些片段与pcnacdna序列一致。回收sali-bamhi片段并将其反向（定向克隆）插入到pdor-neo（6.5kb）的bamhi-sali位点间，经连接、转化和酶切，鉴定筛选出重组质粒（图1），并将其命名为pdr-pcna。
⒉细胞生长曲线：sgc/pcna细胞经g418筛选后，其生长速度与亲本细胞sgc-7901相比明显减慢，在培养第5天，细胞生长抑制达59％。而sgc/neo细胞生长速度与亲本细胞相比，无明显改变。
⒊细胞内mrna水平变化：pcna正义rna单链探针检测到sgc/pcna细胞有较强的杂交信号，而sgc-7901细胞无杂交信号产生。表明pdr-pcna已整合至sgc-7901细胞染色体中，并有较高浓度的pcna反义rna表达。反义pcna rna单链探针检测到sgc-7901细胞有强杂交信号，而sgc/pcna细胞也有杂交信号出现，但较sgc-7901细胞明显减弱，表明sgc/pcna细胞正义pcna mrna的表达被部分抑制。经对杂交斑点薄层扫描（cx-9000薄层扫描仪，日本岛津），sgc/pcna细胞pcna mrna被抑制47.5％。
⒋免疫组化染色：免疫组化染色显示，sgc/pcna细胞体积缩小，阳性细胞所占比例及染色深度较sgc-7901细胞明显降低，而sgc/neo与sgc-7901大体相同。用图像分析法对每张染片5个高倍视野中124个阳性细胞灰度、面积进行测定，结果显示两组差异有非常显著性（p＜0.0001）。